| sgRNA構(gòu)建建議教程 |
| 發(fā)布時(shí)間:2019-11-26 10:25:06 | 瀏覽次數(shù)： |
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sgRNA構(gòu)建建議教程
1， 引物設(shè)計(jì)，https://crispr.cos.uni-heidelberg.de/； 2， 引物退火，引物稀釋到20nM，正反向引物分別取10ul混合，取0.5-1L水加熱到沸騰，混合后引物放入，自然冷卻到室溫（2-4小時(shí)）； 3， 酶切連接，取200ng質(zhì)粒（不用太多，減少自連），取5ul退火的引物，T4連接酶和內(nèi)切酶10×bufffer分別取0.5ul，ddH2O補(bǔ)到10ul 4， PCR儀器設(shè)置程序（時(shí)間緊張可以減少循環(huán)數(shù)或者減少循環(huán)內(nèi)時(shí)間）
5， 產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化； 6， PCR檢測(cè)，用sgRNA引物，配合載體上引物PCR檢測(cè)； 7， 送測(cè)序
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