雙靶點CRISPR載體構建 (哺乳動物細胞)

上海海吉浩格生物科技有限公司

1. CRISPR/Cas9核酸酶切靶序列原理圖

2 相關載體圖譜

2.1 中間載體 ，sgRNA載體（預設有BbsI酶切位點）

中間載體

2.2 CRISPR/Cas9骨架載體，表達CAS9，同時有完整的sgRNA表達框

含有CAS9的骨架載體

（骨架載體可以換成PX459、PX461，PX462、lenticrispr V2、lentiguide-puro或者其他同種gRNA scaffold的質粒）

3. 基因組靶位點選擇和雙鏈接頭設計

3.1 靶位點選擇

根據目的基因的物種在sgRNA設計網站上是設計靶點序列，根據需要選擇特異性好的兩個sgRNA靶點序列。

注（20nt靶點中F和R是為了標記序列方向的堿基，F--R為正向，R--F為反向互補;N和M都代表任意堿基，本文N20代表sgRNA1，M20代表sgRNA2）

對一個目的基因設計2個靶點。建議在ORF 5’區和功能結構域各設計1個靶點，使之任何1個靶點的突變都可以產生功能缺失，或2個靶點之間的序列被敲除。

3.2引物設計

PCR產物核心公共序列

gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttgttttCTAGCAAAATAGGCTGTCCCCGCGGGGCATGACTATCGTCgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccG

PCR擴增后的序列

GaagacaccaccG-FNNNNNNNNNNNNNNNNNNR-gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttgttttCTAGCAAAATAGGCTGTCCCCGCGGGGCATGACTATCGTCgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccG-FMMMMMMMMMMMMMMMMMMR-gtttaggtcttc

引物共用序列

F: GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAA

R: CGGTGTTTCGTCCTTTCCAC

設計完成的序列

sgRNA1-F(PX458):

5-gaagacaccaccGFNNNNNNNNNNNNNNNNNNRGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3

sgRNA2-R:

5- gaagacctaaacRMMMMMMMMMMMMMMMMMMFCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC -3

注1：這一對引物是以PX458/PX459為骨架載體，選擇BbsI酶切位點（lentiguide和lenticrispr v2建議設計為BsmBI），同時正向引物需要加長;

注2：這種方法設計引物比較長，引物合成和后續PCR會有困難，也可以每條sgRNA設計兩個短的引物進行巢式PCR。

3.3 PCR擴增序列

根據設計的兩個靶點的引物，擴增插入序列

以pCMV-sgRNA-hU6-Twinstrep為模板擴增得到如下目的序列

4 中間gRNA表達盒與表達CAS9骨架載體的連接

本載體系統可采用2種策略進行Cas9載體和多個gRNA表達盒片段的一次連接組裝： 

策略I：用Golden Gate cloning (ligation)方法 (Engler et al., 2008; 2009)；

策略II：是傳統的酶切回收保存，酶切后的載體可以多次使用，片段單獨酶切回收的方法。注：策略II載體單獨回收保存，設計中間gRNA表達盒擴增引物時，可以自由選擇實驗室比較適宜的IIS限制性內切酶，不一定需要和載體同樣的酶。

5 測序檢測

構建成功之后的雙sgRNA表達框如下

兩個表達框中間設計有測序引物RVP3可以測序sgRNA2表達框，測序引物RVP4可以測序sgRNA1表達框。因兩個表達框序列相識度比較高、結構復雜，可能會導致測序結果不好。如果骨架載體常用建議在骨架載體上重新選擇引物測序，選距離兩側大于200bp遠的位置設計測序引物。

附件

中間載體pCMV-sgRNA-hU6-Twinstrep介紹

1，pCMV-sgRNA-hU6-Twinstrep中插入的sgRNA表達框不是正常的結構，而是倒置的結構，不能單獨使用，需要配合原有的sgRNA表達框（插入hU6- -gRNA scaffold之間）使用，才能形成（hU6- gRNA scaffold-hU6- gRNA scaffold）雙表達框結構。

插入序列結構 BbsI-gRNA scaffold-測序引物-hU6啟動子-BbsI

紅色G是根據addgene部分構建好的質粒經驗，在sgRNA的20個堿基之前，建議保留sgRNA插入紅色G和gRNA scaffold之間。

插入序列中引入引物RVP3和RVP4作為測序引物，是熒光素酶報告基因質粒的常用引物，為防止和Cas9骨架質粒引物重復導致無法測序。為了壓縮質粒大小（省錢），兩個表達框之間沒有插入太多堿基，盡管插入兩個比較常用引物序列，結構復雜也有可能導致測序套峰或者中斷的可能。如果測序不好建議在骨架質粒上設計引物測序

載體中sgRNA表達框兩側都加了BbsI酶切位點，在以pX458/pX459等酶切位點為BbsI為酶切位點的Cas9骨架載體時候，引物可以相對小一些。

5-gaagacaccaccGFNNNNNNNNNNNNNNNNNNRGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3

2，為了不浪費的原則，我們構建載體的時候將這個sgRNA-U6的表達框插入到一個哺乳動物過表達載體中，切掉sgRNA-U6表達框就是一個完整的帶有Twin-Strep-tag (Schmidt et al., 2013)的超小過表達空載體。sgRNA表達框兩側設計有兩個XhoI酶切位點，用XhoI酶切之后回收自連即可。

更多信息請到官網查詢

www.jdchen.cn